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熙寧小課-第96期 | LC-MS檢測siRNA藥物的案例分享
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時間:2023-02-23

小干擾RNA(small interfering RNA; siRNA)屬于小核酸藥物中重要的一種藥物類型,也被稱為短干擾RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA),是長度在20到25個核苷酸的雙鏈RNA,在生物學上有許多不同的用途。

其結(jié)構如圖1a所示,雙鏈RNA由正義鏈和反義鏈組成,在3‘端有兩個堿基的游離,未經(jīng)修飾的siRNA在體內(nèi)很快被降解,目前主要采用納米遞送系統(tǒng)(圖1b)或者設計成GalNAc(乙酰半乳糖胺)-siRNA復合物(圖1c)。SiRNA藥物作用機理如圖2所示,siRNA片段與RISC(RNA誘導沉默復合體)結(jié)合,RISC由Argonaute-2 (Ago-2)、Dicer和TAR-RNA-結(jié)合蛋白(TRBP)組成,然后RNA的兩條鏈分開,其中一條鏈從復合物上分離,5'端雙鏈穩(wěn)定性最低的那條鏈被選擇出來,穩(wěn)定的并入沉默復合物中,可激活RNA干擾,與目標mRNA互補序列特異性結(jié)合實現(xiàn)mRNA降解。如圖3所示,目前全球已上市5款siRNA藥物,中國大陸暫無siRNA 藥物上市,大多處于均臨床和臨床前研究階段。

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圖1a


Lipid polymer NPs

 

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圖1b

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圖1c

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圖2

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圖3

基于LC-MS檢測siRNA有諸多難點,比如化合物極性大,色譜保留弱,此外siRNA藥物為雙鏈結(jié)構,需要進行雙鏈解鏈,檢測單鏈濃度,因此需要將正義鏈和反義鏈在色譜保留上盡量分離,降低雙鏈相互干擾的影響;由于藥物容易被限制性核酸內(nèi)切酶降解,因此需要重點關注穩(wěn)定性問題。

在質(zhì)譜檢測方面,由于其檢測局限性,對于分子量較大的siRNA藥物,一般以多電荷形式呈現(xiàn),此外強酸性化合物需要在負離子模式下進行,該藥物還易與金屬離子螯合,諸多因素導致了LC-MS檢測siRNA在靈敏度方面具有巨大的挑戰(zhàn)。常規(guī)的樣品前處理(蛋白質(zhì)沉淀、液液萃取、固相萃取)方法不能適用于siRNA藥物提取,因此需要在提高提取回收率、前處理效率和結(jié)果重現(xiàn)性做出更多的努力,下面總結(jié)了相關實驗內(nèi)容。

一、 前處理

本實驗采用液液萃取方法,如圖4,該方法前處理簡單,耗時短,重現(xiàn)性好,成本低廉,非常適合高通量的樣品前處理。實驗操作需在冰浴黃光下操作保證樣品中待測物穩(wěn)定性。

 

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圖4


二、線性、精密度和準確度

本實驗線性范圍為正義鏈5~2500 ng/mL,反義鏈5~2500 ng/mL,代表性標準曲線見圖5a(正義鏈)和圖5b(反義鏈),相關系數(shù)均r>0.999。表明線性關系良好。

通過考察3個分析批,5個濃度質(zhì)控樣品,用以評估該方法的精密度和準確度。結(jié)果顯示批內(nèi)精密度和準確度(含LLOQ QC的所有濃度質(zhì)控)準確度偏差范圍為-7.6~10.1%、-8.5~9.3%,%CV最大值分別為7.3%、6.4%;批間精密度和準確度(含LLOQ QC的所有濃度質(zhì)控)準確度偏差范圍為-5.0~6.7%、-6.3~8.3%,%CV最大值為5.0 %、5.4%。

 

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圖5a

 

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圖5b

 三、選擇性

選擇性考察不同來源的空白基質(zhì)以及高脂,溶血基質(zhì),評估空白基質(zhì)對待測物和內(nèi)標的干擾。同時考察了內(nèi)標對待測物的干擾,圖6a為空白基質(zhì)圖譜,圖6b為定量下限和內(nèi)標圖譜。

 

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圖6a

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圖6b

此外本實驗同時考察了不同個體間基質(zhì)效應,高脂溶血基質(zhì)效應,提取回收率、全血穩(wěn)定性,以及基質(zhì)中穩(wěn)定性,包含短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、處理后樣品穩(wěn)定性等,所有驗證項目均滿足接受標準后,表明該方法能用于后續(xù)的臨床樣品分析。siRNA質(zhì)譜檢測存在較大的技術挑戰(zhàn),若對該檢測內(nèi)容非常感興趣可以關注熙寧生物于2023年02月23日進行的寡核苷酸藥物質(zhì)譜檢測生物分析策略的視頻直播回放,相信經(jīng)過這場直播將會讓您對該類型藥物檢測有更多的了解,解答心中的諸多疑惑。

四、結(jié)束語

熙寧生物質(zhì)譜平臺能夠提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各項生物樣品分析服務,支持小分子藥物、多肽、寡核苷酸、PROTAC以及ADC等大分子藥物的方法開發(fā)、驗證和樣品檢測。平臺配備了多套高端液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和Watson LIMS在內(nèi)的生物分析系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)以及各種先進輔助設備,可以滿足各類型藥物臨床試驗的檢測需求,極大提高了實驗效率和質(zhì)量,更高效地幫助客戶進行藥品研發(fā)。


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